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La télomérase est une ribonucléoprotéine responsable du maintien des télomères dans presque toutes les cellules eucaryotes. L'enzyme est capable d'utiliser un segment court de sa sous-unité de l'ARN en tant que matrice pour la transcription inverse de d (TTAGGG) répète sur les extrémités des chromosomes humains. La transfection avec la télomérase a été montré pour conférer l'immortalité sur plusieurs types de cellules humaines. De plus, l'activation de la télomérase semble être l'un des événements clés nécessaires à la transformation maligne des cellules normales. L'inhibition de l'activité télomérase dans les cellules transformées résultats de la cessation de la prolifération cellulaire dans des cultures et fournit la justification du choix de la télomérase en tant que cible pour la thérapie anticancéreuse. Utilisation N3 & # x02032 oligonucléotide; & # x02192; P5 & # x02032; phosphoramidates (IP), nous avons identifié une région de la sous-unité de la télomérase humaine d'ARN (hTR) & # x0223c; 100 nt en aval de la région de modèle dont l'intégrité structurelle apparaît cruciale pour l'activité télomérase enzymatique. Les oligonucleotides destinés à ce segment de hTR sont des inhibiteurs puissants et spécifiques de l'activité de télomérase dans des dosages biochimiques. Mutant la télomérase, dans lequel trois nt de hTR ont pas complémentaire d'une NP 15 nt, a été jugée réfractaire à l'inhibition par ledit oligonucléotide. Nous avons également démontré que la liaison de NP, les oligonucleotides à cette hTR résultats du site allostérique dans une nette diminution de l'affinité d'un substrat de télomérase (de l'amorce d'ADN simple brin) pour l'enzyme. INTRODUCTION La télomérase est l'enzyme responsable du maintien de la quasi-totalité des télomères dans les cellules eucaryotes. Il est une ribonucléoprotéine qui utilise une séquence courte à l'intérieur de sa sous-unité de l'ARN en tant que matrice pour la transcription inverse, la synthèse d (TG) riche en répète, qui comprend le chez les vertébrés hexanucléotide d (TTAGGG) (1). Dans les tissus humains, l'activité de télomérase peut être détecté dans le germe et les cellules souches, mais pas dans les cellules somatiques ou plus différenciées (2). L'absence d'activité de télomérase conduit à l'érosion des telomeres en raison de l'incapacité de la machinerie de réplication classique de dupliquer les extrémités des chromosomes linéaires (3). Les cellules cultivées in vitro peuvent subir la sénescence lorsque leurs télomères raccourcissent (4). L'expression de différentes protéines oncogènes viraux dans les cellules leur permet de contourner cet état de l'arrestation et de la croissance re-entrer dans le cycle cellulaire (5). Cependant, à un point critique, a poursuivi la prolifération cellulaire en l'absence de résultats de l'activité de la télomérase dans une instabilité chromosomique & # x02014; un phénomène connu comme la crise de la cellule (6, 7). Bien que la crise se réfère normalement à des cellules cultivées en culture, les données provenant de gènes knock-out de l'ARN d'une télomérase chez la souris suggèrent fortement que des événements analogues peuvent également se produire in vivo (8, 9). Pendant la crise, la plupart des cellules dans une population subissent la mort par apoptose. Dans de rares cas cellules peuvent sortir de la crise, qui est presque toujours concomitante à la ré-acquisition de l'activité de la télomérase (10). Les cellules exprimant la télomérase ont le potentiel d'être immortel, qui dans les fibroblastes, les cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine et les cellules endothéliales semble également être suffisante pour l'immortalité proliférative (11 & # x02013; 13). En outre, l'expression de la télomérase est l'un des événements clés nécessaires à la transformation maligne des cellules in vitro et in vivo (14) qui sert à expliquer la corrélation antérieure reliant l'activité télomérase avec la grande majorité des tumeurs malignes (15). Ceci, ainsi que la constatation que la sur-expression d'une forme dominante négative de l'enzyme pourrait conduire lignes de cellules tumorales dans la crise (16), à condition que la justification du choix de la télomérase comme une cible intéressante pour la thérapie anticancéreuse. In vitro . télomérase catalyse l'addition de d (TTAGGG) se répète sur un substrat d'ADN monocaténaire. Deux composants de télomérase sont nécessaires et suffisantes pour l'activité in vitro. un ARN, dont une partie sert de matrice pour la synthèse de séquences répétées en hexanucléotidiques, et une protéine qui comprend la sous-unité catalytique. ARN de la télomérase vertébrés sont similaires en longueur et récemment une structure secondaire a été proposée sur la base de comparaisons phylogénétiques (17). Plusieurs domaines conservés émergé de cette comparaison. Dans le 5 & # x02032; - Demi de l'ARN, une structure de pseudonoeud putatif a été identifié en plus de la région de modèle. Trois domaines conservés pourraient être également trouvé dans le 3 & # x02032; - half de la molécule. L'un d'eux, la boîte H & # x0002f; ACA domaine, a été reconnu précédemment dans l'ARN de la télomérase humaine (hTR) et jugées indispensables pour le traitement et la stabilité (18) ARN. Les principaux H & # x0002f; ACA snoRNA protéines se sont révélés interagir avec hTR (19 & # x02013; 21) et sont probablement partie de l'holoenzyme de télomérase. Les composants de protéine de la télomérase (de Terts) qui ont été identifiées dans la levure, les ciliés et les mammifères sont de même taille (& # x0223c; 100 & # x02013; 130 kDa), mais leur région d'homologie de séquence est limité à une petite partie du produit de gène . Bien qu'il y ait un petit tronçon d'acides aminés qui représente un motif unique parmi les Terts (22), la majorité de l'homologie est partagée avec d'autres transcriptases inverses (RTS). Ces motifs RT sont des éléments structuraux essentiels, comme il a été démontré substitutions d'un seul acide aminé à abolir l'activité télomérase (23 & # x02013; 26). Ces informations ont une utilité limitée, mais, en facilitant la conception d'inhibiteurs de la sous-unité catalytique. En dehors des analogues de nucléosides, en l'absence de l'information additionnelle de construction, il est difficile d'envisager une approche rationnelle pour le choix des inhibiteurs de site actif de la télomérase. Le composant ARN, d'autre part, semble plus favorable à une telle approche rationnelle et peut être un candidat idéal pour une approche à base d'oligonucléotides à l'inhibition. En effet, il y a eu plusieurs rapports décrivant des oligonucléotides complémentaires de la région de modèle comme de puissants inhibiteurs de l'enzyme (27 & # x02013; 30). Nous avons conçu des oligonucléotides modifiés complémentaires de la région de modèle de hTR, et nous avons trouvé ces composés à inhiber la télomérase avec la haute puissance in vitro (IC 50 valeurs de & # x0223c; 1 nm; R. Pruzan et S. Gryaznov, données non publiées). Ce sont N3 & # x02032; & # x02192; P5 & # x02032; phosphoramidate (NP) oligonucléotides, où un x02032 3 & #; amino groupe est substitué pour le 3 & # x02032; Oxygène dans le 2 & # x02032; anneau - deoxyribose. Ces composés se sont avérés former des duplex très stables avec de l'ARN simple brin, sont résistants aux nucleases et afficher dégradation haute spécificité pour des cibles d'ARN et d'ADN, avec une relativement faible affinité pour les protéines (31). Alors que oligonucléotides NP ciblées contre la région de modèle de hTR sont inhibiteurs de la télomérase puissants, nous étions intéressés à trouver des régions supplémentaires de l'ARN qui pourrait être sensible à l'inhibition par des oligonucléotides NP. Nous avons identifié un segment de hTR près de 100 nt en aval de la zone de modèle qui est sensible à l'inhibition par des oligonucléotides complémentaires NP à cette région. Lors de la liaison d'un oligonucleotide NP de cette région, nous avons constaté une nette diminution de l'affinité de l'amorce d'ADN simple brin pour l'enzyme. MATÉRIAUX ET MÉTHODES Les extraits d'activité télomérase et dosage La télomérase a été préparé à partir de 293 cellules en suspension que sur-exprimé le gène de hTERT, en utilisant un promoteur du virus du sarcome myéloprolifératif (MPSV). Des extraits cellulaires entiers ont été préparés à partir des culots cellulaires congelés. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans une hématocrite de x02018 & #; # H & x02019; tampon & # x0005b; HEPES 10 mM pH 7,9, 1 & # x000a0; mM MgCl2. 1 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,5 & # x000b5; g & # x0002f; ml de leupeptine), puis lysées avec un homogénéisateur Dounce. La concentration de sel dans le lysat a été ajusté à 0,3 M de NaCl, qui a été agité pendant 15 & # x000a0; min, puis centrifugé à 100 000 g. Du sulfate d'ammonium solide a été ajouté au surnageant (42 & # x00025; saturation) et les protéines insolubles ont été sédimentées. Les culots ont été remis en suspension dans un cinquième de leur volume d'origine et dialysées contre le tampon & # x02018; A & # x02019; & # x0005b; HEPES 20 mM & # x02013; KOH pH 7,9, 1 mM de MgCl2. 1 mM de DTT, 1 mM d'éthylène glycol-bis (& # x003b2; aminoéthyl éther) - N, N, N & # x02032; , N & # x02032; - tetraéthanoïque (EGTA), 10 & # x00025; glycérol & # x0005d; contenant 0,1 M de NaCl. Après dialyse l'extrait a été centrifugé à 25 000 g pour éliminer les matières insolubles. La télomérase est purifié par Chromatographie d'affinité anti-sens analogue à des procédés décrits précédemment, en utilisant un x02032 2 & #; - O - Me ARN complémentaire de la région de matrice de hTR (32, 33). Extraits purifiés par affinité ont été encore purifiés par Chromatographie de filtration sur gel (G5000PW, Tosoh Biosep LLC). Extraits contenaient entre 0,1 et 0,2 pmol de la télomérase par ml d'extrait, tel que déterminé par analyse northern blot quantitatif de hTR et en mesurant l'activité en utilisant des conditions qui permettaient seulement une addition d'un seul nucleotide à une amorce pré-lié. L'activité a été déterminée en incubant l'extrait de télomérase avec 100 nM d'amorce & # x0005b; d (TTAGGG) 3 & # x0005d ;, 200 & # x000b5; M dTTP, 50 & # x000b5; M dGTP, 10 & # x000b5; M dATP, 10 & # x000b5; Ci & # x0005b; & # x003b1; - 33 P & # x0005d; dATP (2000 & # x02013; 4000 Ci & # x0002f; mmol) dans un tampon contenant 50 mM de (N-2-hydroxyéthyl pipérazine N & # x02032 ; -3 propanesulfonique) & # x02013; NaOH pH 8,5, 1 & # x000a0; mM MgCl2. 1 & # x000a0; mM de DTT, 5 & # x00025; glycerol, 0,5 mM d'EGTA et 100 mM de KOAc dans un volume réactionnel final de 40 & # x000b5; l. Les incubations ont été effectués régulièrement pendant 90 min à 37 & # x000b0; C. Les réactions ont été terminées par SDS (0,1 & # x00025;), de l'EDTA (2,5 mM) et NaCl (100 & # x000a0; mM) dans un volume final de 200 & # x000b5; l. ADN simple brin (50 & # x000b5; g) a été ajouté en même temps que le pyrophosphate de sodium (5 mM); les réactions ont été ajustés pour 5 & # x00025; l'acide trichloracétique (TCA) (de x0002f w & #; v) et a permis de mettre sur la glace pendant 30 min. Après centrifugation, les culots ont été suspendues dans l'eau et re-précipitées avec froide 5 & # x00025; TCA (de x0002f w & #; v). Le précipité a été recueilli sur un filtre en fibre de verre (n ° 31;. Schleicher et Schuell), lavé avec de 1 & # x00025; TCA froid (x0002f w & #; v) suivi par de l'éthanol. Les filtres ont été séchés à l'air et comptées après addition de liquide de scintillation. Comptages de fond, qui ont été tirées de réactions effectuées sans addition d'amorce (ou en présence d'EDTA 5 mM) ont été soustraites des chiffres totaux. Inhibition enzymatique a été suivie en traçant l'activité enzymatique en fonction du log de la concentration en inhibiteur. IC 50 valeurs ont été obtenues en ajustant l'équation suivante pour les données en utilisant le paquet KaleidaGraph logiciel (Synergy): Y & # x000a0; & # x0003d; & # x000a0; b & # x0002b; (A & # x02013; b) & # x0002f; & # x0005b; 1 & # x0002b; 10 exp (log c & # x02013; x) & # x0005d ;, où b et un représentait les valeurs inférieure et supérieure de la courbe sigmoïde, respectivement, et c représente la concentration d'inhibiteur où 50 & # x00025; On observe une activité (CI50). La liaison d'oligonucleotides en utilisant des gels natifs NP Oligonucléotides NP ont été marqués à l'aide & # x0005b; & # x003b3; - 32 P & # x0005d; l'ATP et de la polynucleotide kinase. Les activités spécifiques de l'année 2000 & # 4000; x02013 cpm & # x0002f; fmol d'oligonucléotides ont été obtenus. Affinity télomérase purifiée (1 fmol) a été incubé avec l'oligonucléotide marqué (2 & # x000a0; nM) pendant 30 min à température ambiante dans un volume de 20 & # x000b5; l. La moitié de chaque échantillon a été traitée par la protéinase K (100 & # x000b5; g & # x0002f; ml, 0,2 & # x00025; SDS) pendant 10 min à 37 & # x000b0; C. Les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur un gel natif. Le gel (140 & # x000d7; 170 & # x000d7; 1,5 mm) contenait 3,5 & # x00025; acrylamide (1:60 bisacrylamide), 0,5 & # x00025; agarose, Tris 75 mM et 75 mM de glycine. Le gel a été pré-course pendant 30 min, puis une électrophorèse à 200 V jusqu'à ce que le colorant de xylène cyanole migré de 10 cm. Les gels ont été séchés et analysés avec un Phosphorlmager (Molecular Dynamics). Détermination des taux de amorce de dissociation Mitchell et Collard premier podium de l'équipe sécurisé 1 - 2 Retour à Nouvelles Équipe de course junior Arden dirigé à Thruxton, plus rapide circuit du Royaume-Uni pour les rondes sept, huit et neuf le week-end. L'équipe était à la recherche très forte dans les premiers tours de qualification le samedi matin, la course P1, P2 et P4. Être le premier à entrer un pitstop, Sandy Mitchell est venu pour pneu et le changement d'aile avant et ensuite à dominer qualification par huit dixièmes (1: 13.264). Ricky Collard a manqué de peu P4 avec seulement 0,021 secondes entre la deuxième et la quatrième place, comme il a chuté à P5 dans le dernier tour (1: 14.100) et Enaam Ahmed terminé P14 (1: 14,661). À partir de la pole position, Sandy Mitchell mal jugé son escapade, glisser à la troisième place derrière Matheus Leist de Double R et Développements de JDH la voiture de Sennan Fielding. En raison d'un incident et les voitures échoués, la voiture de sécurité est sortie en piste à la fin du tour d'ouverture rester jusqu'à ce que le sixième tour. Bondir sur Fielding jusqu'à Woodham Hill pour sécuriser deuxième et Leist travers Eglise au tour suivant, Sandy a repris la tête. Ricky Collard de Hampshire a chuté quelques endroits tout au long de la course en septième course avec seulement trois tours à faire, il a fustigé à travers le peloton pour franchir la ligne en quatrième position, en l'aidant à affiner son déficit de points à Daniel Ticktum de leader du championnat Fortec. Enaam fait un bon début de 14 ème. gagner huit places d'ici la fin du premier tour, en séjournant dans 6 e pour les plus de 50% de la course, avant de descendre à franchir la ligne à la huitième pour le rendre trois voitures Arden dans le top huit. Les sept finitions ont été inversés pour la grille de départ de la course dimanche matin - un régal pour les milliers de spectateurs qui étaient arrivés à Thruxton. Sandy à partir de 7 ème. Enaam derrière lui en huitième position, ratant par une position de la grille inversée pôle et Ricky à partir de 4 ème. Le slipstreaming bataille de vingt minutes a vu trois pilotes différents prennent les devants, le résultat reste incertain jusqu'au dernier tour. Brisant son record du tour day-old, Sandy chargé à travers le pack assurer la deuxième place dans le dernier tour. Ricky a fait un retour à la 4 e après avoir glissé vers le bas à la huitième au troisième tour, manquant de peu sur un podium en seulement 0,4 secondes couvrent la deuxième à la quatrième place à l'arrivée. Enaam fait trois autres Arden voiture haut de huit arrivée, franchissant la ligne en 7 e et en faisant la troisième marche du podium pour la classe de recrue. Ricky a grimpé au sommet de la table de championnat après la course à trois le dimanche après-midi après la 15-year-old maison Sandy Mitchell pour en faire un résultat TRS Arden 1-2. Sandy a commencé à nouveau à partir de la pole position et a fait un meilleur départ que ses deux précédentes courses menant lumières pour drapeau pour 99% de la course et revendiquant sa deuxième victoire en carrière de course de voiture. Ce fut une course dés pour Ricky, mais comme il a pris la deuxième place de Lando Norris Carlin lors du septième tour et Norris puis regagner le lieu cinq tours plus tard, la course était pas terminée. Ricky puis retrouvé deuxième et ramené à la maison pour prendre la deuxième marche du podium. Enaam franchir la ligne en 10 e du 13 e apportant plus de points à la maison pour le conducteur et les championnats de recrue. Sandy Mitchell a commenté: "Quel week-end fantastique de course d'avoir deux victoires et une seconde seule est fantastique, mais avoir également définir le nouveau record du tour de la classe Formule MSA et meilleure recrue pour les trois races est tout simplement génial Il est.. un grand sentiment d'obtenir ma première victoire monoplace et je voudrais juste remercier tout le monde tellement à TRS Arden et tous ceux qui ont aidé et m'a soutenu, merci! " Enaam Ahmed a commenté: "Je fait de bons progrès dans ma propre course. Je suis en mesure de venir à partir du milieu emballer jusqu'à l'avant de la grille et a été capable de rester avec les meilleurs gars! Je suis vraiment impatient de Oulton Park au début de Juin ". Ricky Collard a commenté: "Mon circuit de la maison m'a accordé avec la tête du championnat, et une grande performance de l'équipe nous a accordé une avance substantielle. La voiture était excellente ce week-end, l'équipe et moi apportons des améliorations tous les jours pour nous assurer de conserver la tête dans les deux championnats. " Contexte Bax peptide inhibiteur P5 (BIP P5) est un inhibiteur de peptide de translocation de Bax à la mitochondrie [1]. BIP P5 est un peptide inhibiteur de membrane perméable à la translocation de Bax à la mitochondrie. Dans les cellules HeLa, BIP P5 cellules protégée contre l'apoptose UVC - et STS-induite. Dans les cellules de gliome U87-MG, des cellules MCF-7 du cancer du sein et des cellules du cancer de la prostate LNCaP, BIP P5 également inhibé l'apoptose induite par des médicaments anti-cancéreux cisplatine, l'étoposide et la doxorubicine. Alors que BIP P5 n'a pas supprimé UVC - ou apoptose STS-induite dans les cellules déficientes Bax (DU145), qui proposait BIP P5 supprimé seulement apoptose Bax médiation. L'activation des caspases et la libération de cytochrome c des mitochondries déclenchées par des stimuli apoptotiques ont également été significativement inhibés par BIP P5. BIP P5 inhibé l'interaction de Ku70 et Bax endogène d'une manière dépendant de la dose [1].